Wolfgang Buckel

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Forschungsgebiet

Uns interessieren Enzyme, deren Katalysen über radikalische Zwischenstufen verlaufen. Gut bekannte Mitglieder dieser Gruppe verwenden Sauerstoff, S-Adenosylmethionin oder Coenzym B12 als Radikalgeneratoren. Wir untersuchen 2- und 4-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratasen, die Ketylradikale (Radikalanionen) durch Flavin und Eisen-Schwefel-Cluster vermittelte Ein-Elektronen-Transporte erzeugen. Diese Enzyme sind an der Fermentation von Aminosäuren durch Clostridien und einigen anderen anaeroben Bakterien und Archaeen beteiligt. 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratasen benötigen Aktivierung durch eine ATP-abhängige Ein-Elektronen-Reduktion, die von einer Eisen-Schwefel-Cluster enthaltenden „Archerase“ katalysiert wird. Die dabei vermutete Konformationsänderung erinnert an einen Bogenschützen (engl. archer), der Pfeile anstelle von Elektronen schießt. Das Elektron für die Archerase wird von Ferredoxin geliefert, das durch die erst kürzlich entdeckte Bifurkation des Komplexes aus Butyryl-CoA-Dehydrogenase und Electron-Transferring-Flavoprotein (ETF) reduziert wird. Dieser Komplex katalysiert die exergone Reduktion von Crotonyl-CoA zu Butyryl-CoA mit NADH, an die die endergone Reduktion von Ferredoxin durch NADH gekoppelt ist. So werden die Elektronen des NADH zu höheren und niedrigeren Redoxpotentialen aufgespalten (bifurkiert), wodurch eine neue Art der Energiekonservierung in Anaerobiern ermöglicht wird.

Forschungsprojekt

Trans-Glutaconsäure, (E)-Pent-2-endisäure, ist eine ungesättigte C5-Dicarbonsäure, die zur Namen gebenden gesättigten Glutarsäure (Pentandisäure) reduziert werden kann. Beide Säuren können in der chemischen Industrie zur Synthese von Polyestern verwendet werden. Glutaconsäure kann darüber hinaus mit αω-Diaminen zu Polyamiden kondensiert werden. Das ideale Ausgangsprodukt für Glutaconsäure wäre Glutaminsäure, die durch bakterielle Fermentation von Zuckern gewonnen wird. Die chemisch sehr schwierige αω-Eliminierung von Ammonium aus Glutaminsäure wird von den anaeroben Bakterien Acidaminococcus fermentans und Clostridium symbiosum in fünf Stufen bewältigt. Glutamat wird zuerst zu Ammonium und 2-Oxoglutarat oxidiert und anschließend zu (R)-2-Hydroxyglutarat reduziert. Aktivierung mittels einer CoA-Transferase liefert (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA, das von der Dehydratase (siehe oben) zu Glutaconyl-CoA umgesetzt wird. Die nachfolgende Decarboxlierung ergibt Crotonyl-CoA, das zu Acetat, Butyrat und H₂ disproportioniert. Für die Produktion von Glutaconat aus Glucose, wurden die Gene der 2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase, der CoA-Transferase und des Aktivators (Archerase) aus A. fermentans, sowie der Dehydratase aus C. symbiosum in Escherichia coli exprimiert. Der neue Weg zweigt beim 2-Oxoglutarat vom allgemeinen Stoffwechsel ab und liefert tatsächlich Glutaconat, bisher allerdings nur 3 mM . Zur Erhöhung der Ausbeute konzentrieren sich unsere Forschungen auf die einzelnen Parameter wie Optimierung der Glucosekonzentration, Verbesserung der Expression der Transferase und Dehydratase-Gene, Erniedrigung der Ethanol-Produktion und Erleichterung des Glutaconat-Exports. Ein weiteres Ziel ist die Reduktion von Glutaconyl-CoA zu Glutaryl-CoA, das durch Co-Expression der Gene einer nicht decarboxylierenden Glutaryl-CoA-Dehydrogenase und dem dazugehörigen ETF aus Syntrophus aciditrophicus erreicht werden soll. Jüngste Experimente zur Substratspezifität der an der Glutaconat-Produktion beteiligten Enzyme zeigen, dass dieser Stoffwechselweg auch zur Reduktion von 2-Oxoadipat zu Adipat, ein Bestandteil von Nylon-6,6, verwendet werden könnte (siehe Abb.).

Literatur zum Forschungsprojekt

1. Buckel W, Zhang J, Friedrich P, Parthasarathy A, Li H, Djurdjevic I, Dobbek H & Martins BM (2012) Enzyme catalyzed radical dehydrations of hydroxy acids.Biochim Biophys Acta Online 8 December 2011

2. Herrmann G, Jayamani E, Mai G & Buckel W (2008) Energy conservation via electron-transferring flavoprotein in anaerobic bacteria. J Bacteriol 190, 784-791.

3. Djurdjevic I, Zelder O & Buckel W (2010) Method for the production of glutaconate. International patent application WO/2010/081885

4. Djurdjevic I, Zelder O & Buckel W (2011) Production of glutaconic acid in a recombinant Escherichia coli strain. Appl Environ Microb 77, 320-322.

5. Parthasarathy A, Pierik AJ, Kahnt J, Zelder O & Buckel W (2011) Substrate Specificity of 2-Hydroxyglutaryl-CoA Dehydratase from Clostridium symbiosum: Toward a Bio-Based Production of Adipic Acid. Biochemistry-Us 50, 3540-3550.